畜牧兽医学报 ›› 2014, Vol. 45 ›› Issue (11): 1866-1873.doi: 10.11843/j.issn.0366-6964.2014.11.018
刘建涛,张强,宋娅静,闫树仙,于君平,张安定,金梅林*
LIU Jian-tao,ZHANG Qiang,SONG Ya-jing,YAN Shu-xian,YU Jun-ping,ZHANG An-ding,JIN Mei-lin*
摘要:
在大肠杆菌中表达与纯化猪链球菌表面蛋白分支酸合成酶,研究其对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞分泌细胞因子的影响,并试图解释其分子机制。以SC19基因组为模板,PCR扩增aroC基因,构建表达质粒,转化到BL21(DE3)中并诱导表达,所得融合蛋白主要以包涵体的形式存在,以8 mol• L-1尿素(含有50 mmol•L-1 Tris,pH8.0)为变性剂,对构建于pET-28a(+)的猪链球菌aroC基因在大肠杆菌BL21中表达的包涵体进行变性、复性、纯化、去除LPS以及除菌。以aroC蛋白体外刺激RAW264.7细胞,共同孵育4 h后用real-time PCR的方法分析IL-1β、TNF-α的mRNA转录量。用ERK1/2、JNK、NF-κB和P38的抑制剂以及TLR2和TLR4的特异性抗体来解释其引起炎性反应的分子基础。结果显示成功对aroC蛋白进行了变性、复性及纯化,该蛋白具有刺激巨噬细胞表达细胞因子的能力,用NF-κB的抑制剂以及TLR4的特异性抗体预处理细胞后能明显降低aroC导致的IL-1β、TNF-α mRNA的转录,用P38的抑制剂预处理细胞后能明显降低aroC导致的TNF-α mRNA的转录量。结果证明aroC在RAW264.7中通过p38MAPK和NF-κB通路促进TLR4依赖的炎性反应。
中图分类号: